خاک (مزرعه ذرت)

بهشهر-ایران

LRC107

Leptinotarsa desemlineata (Say)

پرتغال

LRC137

Leptinotarsa desemlineata (Say)

کانادا

پنج محیط غذایی متفاوت دارای منابع متفاوت کربن و نیتروژن به شرح زیر برای انجام این تحقیق استفاده شد:

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۱- محیط کشت کربن: نیتروزن (۳۵: ۱): شامل چهار درصد گلوکز و یک درصد پپتون
۲- محیط کشت کربن: نیتروزن (۱۰: ۱): شامل ۶/۰ درصد گلوکز و یک درصد پپتون
۳- محیط کشت OSM (دارای فشار اسمزی بالا): شامل هشت درصد گلوکز، دو درصد پپتون و ۵/۵ درصد کلرید پتاسیم
۴- محیط کشت فقیر از نظر مواد غذایی شامل دو درصد پپتون
۵- محیط کشت فقیر از نظر مواد غذایی شامل یک درصد عصاره­ی مخمر
عصاره­ی مخمر و پپتون دارای منابع متفاوت کربن و نیتروژن بوده و به ترتیب دارای نسبت کربن: نیتروژن ۶/۳: ۱ و ۸: ۱ می­باشند (کاساس لوپز^[۱۱۷]و همکاران، ۲۰۰۳). محیط کشت دارای فشار اسمزی بالا با ۵/۵ درصد آگار و بقیه­ی آنها با بهره گرفتن از یک درصد آگار تهیه شدند. بعد از تهیه محیط­های کشت در دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس و فشار ۵/۱ اتمسفر به مدت ۲۰ دقیقه استریل شدند و بعد از خنک شدن آنها تا دمای حدود ۴۵-۵۰ درجه سلسیوس، ۱۸ میلی­لیتر از آنها در فضای زیر هود آزمایشگاه به داخل هر کدام از پتری­های پلاستیکی با قطر ۸ سانتی­متر ریخته شد.
۳-۷- اندازه ­گیری میزان رشد قطری (رشد میسلیومی) کلونی
برای این منظور یک حلقه محیط کشت حاوی قارچ به قطر ۵ میلی­متر از محیط کشت­های مختلف دو هفته­ای از هر کدام از جدایه­ها برداشته شد و در وسط هر یک از محیط­های کشت حاوی مواد غذایی مختلف قرار گرفت. اطراف هر تشتک پتری توسط پارافیلم پوشانده شد. تشتک­های پتری در انکوباتور با دمای ۱±۲۵ درجه سلسیوس و در شرایط تاریکی نگهداری شدند. هر جدایه دارای سه تکرار از هر محیط کشت بود. قطر رشدی کلونی در فواصل سه روزه و تا روز ۱۵ از پشت تشتک پتری بر حسب میلی­متر اندازه ­گیری گردید. اندازه ­گیری قطر کلونی در دو جهت عمود بر هم که بیشترین رشد قطری را داشتند انجام شد و میانگین آنها به عنوان رشد قطری کلنی ثبت شد (صفوی و همکاران، ۲۰۰۷).
۳-۸- اندازه ­گیری میزان اسپورزایی
برای تعیین میزان اسپورزایی هر جدایه روی هر کدام ازمحیط­های کشت، ابتدا یک حلقه­ی ۵ میلی­متری از بخش مرکزی هر کدام از جدایه­ها برداشته شد و حلقه­ی مورد نظر به داخل یک لوله آزمایشگاهی حاوی پنج میلی­لیتر آب مقطر سترون و ۰۲/۰ درصد توین-۸۰ منتقل گردید و بعد از بستن درب لوله آزمایش توسط نوار پارافیلم به شدت به مدت ۵ دقیقه تکان داده شد تا اسپورها از روی محیط کشت جدا شده و به صورت سوسپانسیون درآیند. سپس تعداد کنیدیوم­ها در سوسپانسیون به وسیله­ لام گلبول شمار یا هموسیتومتر برآورد شد (صفوی و همکاران، ۲۰۰۷).
۳-۹- آزمایش درصد جوانه­زنی
برای تعیین درصد جوانه­زنی اسپورها، ابتدا از قارچ­های رشد کرده روی هر کدام از محیط­های کشت حاوی مواد غذایی مختلف، سوسپانسیون کنیدیومی به غلظت ۱۰^۴ کنیدی در هر میلی­لیتر تهیه گردید. سپس در سه نقطه از تشتک پتری حاوی محیط­های غذایی مختلف، و در هر محل یک قطره از سوسپانسیون کنیدیومی قرار داده شد و روی هر قطره یک عدد لامل سترون قرار داده شد. تشتک­های پتری به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور با دمای ۱±۲۵ درجه سلسیوس نگهداری شدند و سپس در زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی ۴۰ برابر مورد بررسی قرار گرفتند. برای هر تیمار سه زمینه متفاوت میکروسکوپ و در هر زمینه تعداد ۱۰۰ عدد کنیدیوم بررسی گردید. کنیدیوم­هایی به عنوان جوانه­زده محسوب گردید که طول لوله تندش در آنها مساوی یا بزرگتر از قطر خود کنیدیوم بود (صفوی و همکاران، ۲۰۰۷).
۳-۱۰- تعیین شدّت بیمارگری ماده تلقیح جدایه­های قارچ B. bassiana
بیمارگری کنیدی حاصل از محیط­های متفاوت کشت از هر جدایه قارچی روی سوسک چهارنقطه­ای حبوبات (Callosobruchus maculatus L.) بررسی شد. این مرحله در سه تکرار و در هر تکرار با ۲۰ عدد حشره کامل انجام گرفت. حشرات مدّت ۲۰ ثانیه در داخل ۵ میلی­لیتر از سوسپانسیون حاوی ۱۰^۷ کنیدی در میلی­لیتر غوطه­ور شدند و به داخل تشتک­های پلاستیکی حاوی یک کاغذ صافی مرطوب همراه ۲۰ گرم لوبیا چشم بلبلی قرار گرفتند. تشتک­های پتری حاوی حشرات تیمار شده در انکوباتور با دمای ۱±۲۵ درجه سلسیوس و با شرایط تاریکی نگهداری شدند و تعداد مرگ و میر حشرات به طور روزانه تا روز ۱۱ ثبت گردید. حشرات مرده از داخل تشتک­های پتری خارج شده و در داخل تشتک­های جدید حاوی کاغذ صافی مرطوب نگهداری شدند. در مواردی که رشد قارچی در سطح بدن حشرات مرده مشاهده گردید، مرگ آنها در اثر آلودگی قارچی محسوب گردید (کاسا و همکاران، ۲۰۰۲).
۳-۱۱- تجزیه و تحلیل داده ­ها
در تمامی آزمایش­های انجام شده از طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار استفاده شد. داده ­های مربوط به تلفات مرحله حشرات کامل سوسک چهارنقطه­ای حبوبات ابتدا با بهره گرفتن از فرمول arcsin√xتغییر شکل یافتند. تجزیه آماری داده ­ها با بهره گرفتن از نرم­افزار IBM SPSS Statistics 16 انجام شد. برای محاسبه [LT₅₀] جدایه­ها از آزمون LIFETEST در نرم­افزار SAS Version 9.1.3 و برای مقایسه میانگین­ها از آزمون توکی در سطح احتمال آماری پنج درصد استفاده شد.
۴- نتایج
۴-۱- تأثیرنوع محیط کشت روی درصد جوانه­زنی کنیدی قارچ Beauveria bassiana
نتایج حاصل از تجزیه آماری داده ­ها نشان داد که با اطمینان ۹۹ درصد بین میزان درصد جوانه­زنی کنیدیوم جدایه­های قارچ مورد نظر کشت شده درمحیط­های کشت مختلف در مدّت ۲۴ ساعت اختلاف معنادار وجود داشت. در مورد تأثیر محیط­های کشت، در سطح احتمال آماری یک درصد ۰۰۱_/۰P< می­باشد.
جدول ۴-۱- نتایج تجزیه واریانس داده ­های مربوط به تأثیر محیط­های متفاوت کشت روی درصد جوانه­زنی جدایه B.bassiana DEBI007

منبع تغییرات

درجه آزادی

مجموع مربعات

میانگین مربعات

F

P

محیط کشت

۴