دقت شود که قبل از تنظیم PH پودر موجود به طور کامل حل شود.
PH این بافر در الگوی حرکت پروتئین ها و صحت روند آزمایش بسیار مهم می باشد پس دقت شود که دقیق تنظیم شود.
بافر ۱x تهیه شده یکبار مصرف نمی باشد و تا زمانی که تغییر قابل توجهی در مقاومت آن ایجاد نشود و افت شدت جریان مشاهده نشود قابل استفاده می باشد.
بافر ۲X SDS gel loading
این بافر دارای SDS جهت باردار کردن نمونه ، مرکاپتواتانول جهت شکستن پیوندهای دی سولفیدی ، گلیسرول و تریس جهت سنگین کردن نمونه و پروموفنل پلو جهت رنگ آمیزی و مشاهده حرکت نمونه در ژل می باشد ، به صورت ۲X تهیه شده و در هنگام استفاده به نسبت یک به یک با نمونه مورد بررسی ترکیب شده و به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه (به طور متوسط ۷ دقیقه) در آب جوشانده شده یا در دمای ۹۵ درجه سانتی گراد در هیت بلاک قرار می گیرد.
بافر رنگ آمیزی کوماسی بلو
کوماسی بلو یک رنگ آمینو تری آریل متان است ، که به صورت محکم اما نه به صورت کووالانسی به کمپلکس پروتئین ها از طریق میان کنش های نیروهای واندروالسی و الکترواستاتیک با گروه NH3+ متصل می شود. محدوده شناسایی پروتئین ها با کوماسی بلو در حدود ۳/۰ الی ۱ می باشد. در این روش پروتئین های جدا شده توسط ژل پلی آکریل امید ، توسط یک محلول فیکس کننده که شامل متانول / استیک اسید است ، رسوب داده می شوند ، سپس محل پروتئین های رسوب داده شده توسط کوماسی بلو شناسایی می شوند. بعد از رنگ بری باندهای آب پروتئین ها نمایان می شود.
برای تهیه این بافر حجم محلول موجود در ظرف بافر را با آب مقطر به ۳۰۰ میلی لیتر برسانید. این بافر یکبار مصرف نیست و تا زمانیکه کیفیت رنگ آن کاهش نیافته است قابل استفاده می باشد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

بافر رنگ برکوماسی بلو
از این محلول برای رنگ زدایی کوماسی بلو از ژل پلی آکریل آمید استفاده می شود. کوماسی بلو به طور اختصاصی به پروتئین ها متصل می شود ولی به آسانی از ژل پلی آکریل آمید جدا می شود.
برای تهیه این بافر حجم محلول موجود در ظرف بافر را با آب مقطر به ۴۰۰ میلی لیتر برسانید.
TEMED
بعنوان کاتالیزور واکنش آکریل آمید و بیس آکریل آمید عمل می کند.
۳-۶-۲-۳ روش انجام SDS-page :
اسلایدهای شیشه ای مخصوص ساخت ژل را به خوبی شسته و در نهایتا برای حذف هر گونه آلودگی به اتانول تمیز شود.
سپس اسلایدهای شیشه ای در داخل سلول مخصوص خود قرار داده و برای اطمینان از عدم نشت ژل ، مقداری اتانول در اسلایدهای شیشه ای ریخته ، به مدت ۱۰ دقیقه در آن قرار گیرد. در صورت عدم نشت با احتیاط ، اتانول واقع در اسلایدهای شیشه ای دور ریخته شود.
بسته به وزن مولکولی پروتئین موردنظر بر اساس جدول ۱ ، اقدام به ساخت ژل Running کنید.
ژل ساخته شده را در اسلاید شیشه ای ریخته تا حدی که ۲ سانتی متر با سطح اسلاید فاصله داشته باشد. بلافاصله بعد از ریختن ژل ، بر روی سطح ژل ، ایزوپروپانول یا اتانول ریخته تا شرایط بی هوازی برای فعالیت TEMED فراهم شده و همچنین سطح ژل را صاف نماید. برای اطمینان از بسته شدن ژل ، مقدار اضافی ژل را در یک لوله اپندورف ریخته و درب آن را محکم ببندید.
بلافاصله بعد از اضافه کردن TEMED ژل شروع به پلیمریزه شده می کند. بنابراین بایستی مواد به ترتیب از بالا به پایین اضافه شود و پس از اضافه کردن TEMED سریعا مخلوط و به فضای بین دو اسلاید شیشه ای اضافه شود. در هنگام ریختن ژل بین اسلایدهای شیشه ای از ایجاد حباب هوا بایستی جلوگیری شود.
وقتی که ژل در داخل لوله اپندورف پلیمریزه شد (حدود ۳۰ تا ۶۰ دقیقه طول می کشد) ، ژل Stacking بر اساس جدول ۲ ساخته شده ، ایزوپروپانول را از سطح ژل دور ریخته و سپس ژل Stacking را تا سطح اسلاید اضافه و بلافاصله شانه تفلونی بر روی اسلاید قرار گیرد.
همانند مرحله ۴ مقدار اضافی ژل را در یک لوله اپندورف ریخته و درب آن بسته می شود (مدت زمان بسته شدن همانند مرحله ۴)
وقتی که ژل بسته شد ، در تانک در حدود ۱ لیتر بافر ۱X Buffer Running Tank ریخته و اسلایدهای شیشه ای را همراه با گیره آن درون تانک قرار دهید. پس از اینکه بافر تانک سطح ژل را کاملا پوشاند به آرامی شانه را از ژل خارج نمایید.
در حین بستن ژل اقدام به آماده سازی نمونه ها شود به این صورت که نمونه ها را با نسبت برابر با بافر بارگذاری مخلوط و به مدت ۷ دقیقه جوشانده شود.
در چاهک نخست ۵ میکرولیتر از مارکر پروتئین و در چاهک های بعدی ، بقیه نمونه ها ریخته شوند.
درب تانک را بسته سپس منبع تغذیه به تانک وصل گردد.
منبع تغذیه را در ۶۰ میلی آمپر تا زمانی که نمونه ها به فصل مشترک ژل Stacking و ژل Running برسد ، تنظیم شود.
بعد از رسیدن نمونه ها به فصل مشترک ژل Stacking و ژل Running منبع تغذیه در ۵۰ میلی آمپر تا رسیدن نمونه ها به انتهای ژل ، تنظیم شود.
۳-۶-۲-۴ رنگ آمیزی کوماسی بلو :
پس از ران شدن نمونه ها بر روی ژل ، اسلایدهای شیشه ای را به آرامی از ژل جدا کرده ، و یکی از ژل ها را به منظور رنگ آمیزی با محلول کوماسی بلو در ظرف پلاستیکی با حدود ابعاد ژل قرار دهید.
سطح ژل را با محلول کوماسی بلو پوشانده و به مدت ۲ ساعت در دور آهسته بر روی شیکر قرار می گیرد.
پس از این مدت زمان محلول کوماسی بلو را دور ریخته و ژل را با آب شستشو دهید تا رنگ های اضافی اولیه شسته شوند.
سپس سطح ژل را با مقداری محلول رنگ بر پوشانده و به مدت ۲ ساعت در دور آهسته بر روی شیکر قرار می گیرد.
در صورت نیاز به رنگبری اضافی ، محلول رنگ بر دور ریخته شده ، سپس محلول رنگ بر تازه اضافه گردد. این عمل تا زمانی که باندهای آبی نمایان شود و ژل دوباره شفاف شود ، ادامه داده می شود.
برای نگه داری ژل می توان از محلول استیک اسید ۷% استفاده نمود.
فصل چهارم : نتایج
۴-۱ نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization
در توالی نوکلئوتیدی اولیه پارامترهایی وجود داشت که کارایی سیستم بیانی در میزبان E.Coli را پایین می آورد. در نتیجه این پارامترها با جایگزینی نوکلئوتیدهای مناسب و ایجاد کدون هایی با راندمان بالا بهینه سازی شد. در تغییرات ایجاد نکات زیر مورد توجه قرار گرفت :
هیچ اسید آمینه ای تغییر نکند.
قالب خواندنی^[۵۰] در ژن نهایی تغییر نکند.
کدون هایی انتخاب شود که بیشترین بیان را در میزبان داشته باشد.
پایداری mRNA مورد بررسی و توجه قرار گیرد.
جایگاه های آنزیم محدود کننده در دو سر توالی بدون تغییر بماند.
پارامترهایی که طی بهینه سازی دستخوش تغییر قرار گرفتند به شرح زیر می باشد :
شاخص سازگاری کدون^[۵۱] یا (CAI) :
از لحاظ کمی مقدار تمایل کدون ، کدون های مترادف با بهره گرفتن از شاخص سازگاری کدونی یا CAI اندازه گیری می شود که بین صفر تا یک متغیر است. زمانی که شاخص برابر صفر باشد به این معناست که همه کدون های مترادف به یک میزان در یک ژن استفاده شده اند و مقدار برابر یک به معنای حداکثر بودن میزان تمایل کدونی بوده و در این مورد فقط کدون های بهینه مورد استفاده قرار گرفته اند که بالطبع آن نشان دهنده بیان بیشتر و دائم یک ژن و به عبارتی تعیین کننده سطح بیان آن خواهد بود. با توجه به این پارامتر میزان CAI برابر با یک ، بهترین حالت بیانی ممکن و بیشتر از ۸/۰ ، حالت بیانی خوب و ۶/۰ ، حالت بیانی متوسط را دارا خواهند بود. در توالی اولیه طراحی شده میزان CAI برابر با ۶۹/۰ بود که با تغییرات نوکلئوتیدی اعمال شده این میزان به ۸۸/۰ تغییر یافت. (شکل ۴-۱)